Conception d’un anticorps à action intracellulaire bloquant la famille de protéines RHOA afin d’étudier un processus cellulaire impliqué dans la cancérisation.

Les fragments d’anticorps monochaîne (nanobody) à action intracellulaire peuvent être considérés comme des outils prometteurs pour étudier les voies de signalisation clés en interférant avec les interactions protéine-protéine. Dans le but d’étudier la famille des petites GTPases RHOA apparentée à RAS, nous avons mis en œuvre, par la technique de phage display, une sélection rigoureuse de nanobody reconnaissant la GTPase active RHOA-GTP. Nous avons ensuite adapté le rapporteur intracellulaire d’interaction protéine-protéine basé sur la méthode tripartite split-GFP pour identifier un nanobody intracellulaire fonctionnel, le RH28, qui ne reconnait pas les autres familles de GTPase telles que la sous-famille RAC apparentée. Cet anticorps intracellulaire bloque efficacement la voie de signalisation RHOA/ROCK. Dans la lignée cellulaire de mélanome métastatique WM266-4, l’expression de RH28 a déclenché un phénotype cellulaire allongé associé à une perte des propriétés de contraction cellulaire, démontrant le blocage intracellulaire efficace des interactions en aval des protéines RHOA/B/C sans qu’il soit nécessaire de manipuler l’expression génique endogène. Ce travail ouvre la voie à de futures stratégies thérapeutiques basées sur la perturbation des interactions protéine-protéine avec des anticorps intracellulaires.

Mise en évidence de la perte de fibres d’actine suite au blocage de la voie de signalisation par le RH18. Les fibroblastes MRC5 exprimant transitoirement soit des contrôles (NR) soit RH28 hs2dAb-6xHis-Myc ont été fixés 20 heures après la transfection et colorés en utilisant l’anticorps tag anti-myc et la phalloïdine Alexa 568 pour détecter les fibres de stress d’actine. Les flèches indiquent les cellules dépourvues de fibres d’actine. Barre d’échelle de 20 μm.

Collaborations et remerciements

• Pôle Technologique du CRCT – Plateau Imagerie, Cytométrie and Vectorologie,
• Fondation pour la Recherche Médicale (FRM).